【摘要】介紹了流體動力色譜(HDC)和障礙色譜(SC)及其在生物、化工分離中的研究進展，著重于它們的分離原理、理論發展及二者之間的聯系與轉化，引用52篇文獻。
　　
　　【關鍵詞】動力學液相色譜,流體動力色譜,障礙色譜，DNA分離，評述
　　
　　AbstractHydrodynamicchromatography(HDC)andslalomchromatography(SC)calledasdynamicliquidchromatography(DLC)wereintroducedandreviewed,mainlyfortherecentdevelopmentofseparationprinciple,theoreticalmodel,andapplications.Fiftytworeferenceswerecited.
　　
　　KeywordsDynamicliquidchromatography,hydrodynamicchromatography,slalomchromatography,deoxyribonucleicacidseparation,review
　　
　　1引言
　　
　　隨著生命科學研究的不斷深入，液相色譜法(LC)在分離純化多肽及蛋白質方面的應用也得到了迅速地發展，盡可能提高其分離度已成為LC研究中*重要的課題之一[1,2]。多年來，研究溶質組分的色譜保留行為基本上依據熱力學因素，即根據各組分在固定相和流動相中的分配系數的差異實現對組分的分離，并且假定組分在該二相間的分配或吸附平衡是瞬時完成的。然而，早在1956年，荷蘭學者VanDeemter便提出了色譜過程的動力學理論——速率理論[3]。他將色譜過程視為一個動態的非平衡過程，研究分離過程中的動力學因素對峰展寬的影響。此后，Giddings等[4]在VanDeemter方程的基礎上，提出了LC的速率方程，即Giddings方程，他們認為溶質在流動相和固定相轉移的過程并不是瞬間達到平衡，實際上組分傳質速度是有限的，說明分離中總是存在著動力學的非平衡過程。液相色譜的分類是依據溶質與固定相之間的作用特征，如電荷作用的離子交換色譜，疏水相互作用的疏水相互作用色譜和反相色譜，親合作用的親合色譜及分子大小的尺寸排阻色譜等。本文介紹的流體動力色譜(hydrodynamicchromatography,HDC)和障礙色譜(slalomchromatography,SC)，其溶質均與固定相之間的作用特征無關，或關系甚小，而主要與流動相的流動特征有關，或是基于動力學因素發展起來的兩種新的色譜方法，二者通稱為動力學液相色譜法。目前,它們已經在測定和分離聚合物、多肽、DNA和生物大分子方面廣泛應用。文獻[5]從與SEC比較的角度簡要地介紹了HDC和SC的分離原理及二者之間的不同點。本文詳細并系統地說明了HDC和SC的分離原理、模型、理論發展、儀器設備和*新應用，并探討了HDC與SC之間的聯系及相互轉化。
　　
　　2流體動力色譜(HDC)
　　
　　HDC是Small等20世紀70年代初就已開發出的一種可同時測定聚合物或膠體乳膠粒的直徑及其分布的方法[6~8]。他們采用了無孔剛性固體顆粒填充色譜柱，待分離乳液在高壓下通過色譜柱時，由于不同大小的溶質所受到的水動力效應的不同，其乳液在流動相中的移動速度也不同，從而實現了聚合物或膠體懸浮液的分離。Mori等[9]進一步發展和完善了HDC,并將其應用到某些天然高分子的分離。后來人們發現在一根直徑為幾百微米的毛細管中同樣也可實現不同粒徑混合物的分離[10]。這種采用毛細管，而不是填充柱作為分離柱的分離方法拓寬了HDC的應用范圍，這在理論研究和實際應用上都有著非常重要的意義。用內徑小于10μm的毛細管(稱其為微毛細管),其分離機理與內徑大于10μm的毛細管略有不同，文獻[11~14]對微毛細管HDC進行了詳細的理論探討和應用研究。
　　
　　2.1HDC的原理
　　
　　2.1.1HDC柱
　　
　　毛細管HDC和填充柱HDC所需色譜裝置大體相同。二者的區別在于毛細管HDC采用管徑不同的毛細管作為分離色譜柱，而填充柱HDC則使用無孔剛性固體顆粒填充的色譜柱。相對于毛細管HDC,填充柱HDC的設備簡單，操作簡便，尤其是檢測手段的簡化，通常使用紫外檢測器便能滿足要求。而毛細管HDC受到進樣量和檢測濃度的限制，要求檢測器較為靈敏，通常使用高靈敏度紫外檢測器或其它手段，如電位分析、激光激發熒光法及激光光散射法等[15]。
　　
　　2.1.2HDC分離模型
　　
　　盡管HDC包括了前述的兩種主要模式，毛細管HDC和填充柱HDC，而大部分有關HDC的理論都以前者為主[16,17]，由于可將填充HDC顆粒間的間隙視為毛細管體系，故填充HDC與毛細管HDC具有相同的分離模型。HDC的分離機理為：當流動相從填料顆粒間經過時，由于水動力效應的存在使其流型為層流拋物面型，溶質在這種情況下的分離主要是借助于靠近填料顆粒表面的低流速區域所產生的排斥效應，大的溶質分子由于受到的排斥效應大于小溶質分子，更容易遠離填料顆粒表面而進入高流速區域，這樣大分子溶質的移動速度大于小分子溶質，從而先于小分子被洗脫出來。有多種模型描述了溶質在HDC中的保留行為，*簡單的僅考慮了幾何學效應，而常用的模型是DiMarzio和Guttman[16,18]及Brenner和Gaydos[17]依據幾何學原理而提出的保留時間和溶質大小的關系。如圖1所示，溶質分子在毛細管內的遷移可用式(1)來表示：
　　
　　R=(1 Bλ－Cλ)－1(1)式中，R=tm/t0為溶質的保留值與無限小的標記物的保留值之比，也稱之為相對保留值；λ=de/dpor,de為溶質的有效直徑，dpor是毛細管的直徑。B和C均為與幾何學有關的常數；C值介于0.5~5之間[１９]，在填充柱里C值介于2.7至2.8之間。
　　
　　從式(1)看出，粒徑不同的顆粒的相對停留時間是不同的，這樣具有不同大小顆粒的溶質便可用HDC法進行分離。由于大分子先于小分子被洗脫出來，因此，雖然它所用分離原理與尺寸排阻色譜(SEC)不同，但其洗脫順序卻與SEC相同。
　　
　　需要指出的是，在式(1)的推導過程中將被測粒子假定為剛性的不旋轉微球，而實際上對于流動體系中的粒子來說，其上下所受的力是不平衡的，在力矩的作用下將發生旋轉,這種轉動又會影響其流動速度。這個現象*早由DiMarzio[１６]和Brenner[１７]等論及。
　　
　　2.2HDC的發展和應用
　　
　　HDC要求溶質分子的大小與流經管道直徑的比值不應小于0.01，一般介于0.01~0.35之間[2０]。在HDC提出的初期，使用小孔徑的毛細管(50~500μmi.d.)，或者使用填充10~20μm填料的填充柱，其內部管道相對較大，因此它們僅局限于分析一些較大的溶質，如纖維和固體顆粒[2１，２２]。一般來說,采用小內徑的毛細管，或非常小的粒徑均勻的微球作為填料時可顯著提**DC柱的柱效，可使用內徑更小的(1~5μm)的毛細管和更小顆粒的填料(1~1.5μm)[１９，23]來提**DC的分離度。如Stegeman等[２４,２５]利用粒徑范圍在1.4~2.7μm單分散SiO2微球為填料，較好地分離了聚苯乙烯顆粒、膠體SiO2顆粒和蛋白質等。考慮到HDC的分離機理在SEC中同樣存在，故可將HDC與SEC結合,從而拓寬所分離溶質分子量的范圍。Cheng等[2６]利用粒徑不同的玻璃微球為填料在填充柱中分離聚苯乙烯顆粒,以此討論了SEC和填充柱HDC之間的異同。Stegeman等[２７]利用填充有多孔的SiO2顆粒和苯乙烯與二乙烯基苯交聯共聚物顆粒的填充柱分離了聚苯乙烯顆粒，認為小分子量聚苯乙烯顆粒主要按SEC機理分離，而高分子量聚苯乙烯顆粒則按HDC機理分離，分子量范圍可擴充至102~107之間。這樣HDC的應用范圍覆蓋了SEC的范圍[1３,２８]。
　　
　　分析分離儀器的微型化是當今科學儀器發展的趨勢，可以減小試劑消耗、提高分離分析效率和縮短分析時間。但是，使用小內徑的毛細管會增加檢測的難度[1３,1４]。為解決這個問題，Chmela等[２９,3０]設計了芯片HDC裝置，采用熒光檢測，在3min內完成了熒光納米級微球的分離與檢測。由于硅微技術可以提供準確的幾何形狀，硬度高，且耐有機溶劑和高溫腐蝕，所以該體系使用1μm×1000μm(深和寬)的硅刻槽作為分離管路，連接體積為300pL的進樣器，并采用壓力驅動流動相。該體系可提供十萬個理論塔板數，已用來分離聚合物和生物大分子顆粒，真正達到了芯片實驗室的程度，并定性地驗證了HDC理論。然而他們認為這種保留和擴散的模型需要從定量的角度上加以描述和改進。Blom等[3１]也設計了熔融硅膠板狀的紫外檢測芯片HDC裝置，使用69mm×0.5mm×1μm的分離管道連接150pL進樣器，其檢測池的深和寬皆為30μm，用此裝置分離了粒徑為26~155nm的熒光分子和聚苯乙烯混合物，并描述了平面HDC保留與擴散行為以及壁效應對擴散的影響。上述兩種芯片裝置中的檢測器與分離管路結合在一起，因此兩者之間無死體積，這樣大大減小了溶質峰的柱外擴散，有效地提高了分離效率。
　　
　　3障礙色譜(SC)
　　
　　3.1SC柱及分理原理
　　
　　3.1.1SC柱
　　
　　SC所用儀器設備與常規HPLC所用設備基本相同。由于溶質在SC中的分離與填料的孔徑和化學性質無關，所以SC對色譜柱的要求相對簡單。已報道有使用C1反相柱[３２]，凝膠滲透色譜柱和[3３,3４]和離子交換色譜柱[３5]，流動相與SEC所用流動相相同，有時為了消除色譜柱的微弱的疏水作用，加入了5%~20%的有機溶劑，如乙睛。
　　
　　3.1.2SC分離模型
　　
　　SC是在1988年依據動力學原理提出的一種新穎的方法，用于分離分子量相對較大(>5kbp)的DNA分子[３６,37]。一般認為，SC的分理機理是：DNA分子的分離主要依靠流速和填料顆粒的大小而非填料的孔徑和化學性質[3８]。填料的作用僅被用來形成填料之間的網狀空隙，當DNA分子進入色譜柱，它需要不斷繞過填料顆粒的球型障礙，就像障礙滑雪一樣，DNA分子越大或填料顆粒越小，則DNA分子穿出色譜柱也越困難。這樣大的DNA分子在填料顆粒間的移動速度小于小的DNA分子，*終在小分子之后被洗脫出來[3９]。Guillaume等[4０]對SC的機理進行了研究，提出了DNA分子在SC里分離的模型，并對該模型進行的驗證[4１]。該模型給出了相對保留值與流動相流速的關系：τ＝ψ(e－kv kv－１)＋τˇ(２)式中，τ為流速在v時DNA分子的保留時間與其完全舒展時(對應于其*高流速時)的保留時間的比值，ψ，k為相應的常數，τˇ為*低流速時的τ值。從式(2)看出，SC模式中溶質的保留值是流速的函數。他們從理論上推導出的與實驗得出的τ進行了比較，結果一致，并給出了τ值與流速v的關系圖。
　　
　　Hirabayashi等[3９]證明溫度也是影響SC分離的重要因素，原因在于流動相的粘度大小與溫度有關。Peyrin等[4２,4３]根據溶液粘度與溫度之的關系給出了在SC中溫度影響DNA保留行為的模型。
　　
　　3.2溶質保留與分離對流速的依賴性
　　
　　SC中兩個DNA片段的分離可以用式(3)來描述[3９,４4]：
　　
　　RRT=tR/tNR(3)式中，RRT為溶質的相對保留時間，tR為溶質的保留時間，tNR為死時間或不保留組分的保留時間。
　　
　　由于流速對DNA分子伸展性的影響[４4]，流動相對填料顆粒間的流體動力學力(hydrodynamicforce)對DNA分子的保留起著重要的作用，隨著流速逐漸增大，相對保留時間(ＲＲＴ)增長；流速增大到一定程度后ＲＲＴ趨于穩定值。Hirabayashi[３８，３９]和Boyes[３７]等進行了驗證。Peyrin進行了理論推導[４4]，并指出流動相流速的增加提高了分離的效率，減小了分離時間，這也是其相對于平衡色譜的重要優點。
　　
　　3.3SC理論的發展和應用
　　
　　自1988年SC提出以來，雖然發展很快，但其應用范圍較窄，且多集中在SC理論研究和DNA分子片段的分離方面。SC為處理和分析大的DNA分子提供了一個新的技術平臺[４５]，這種方法*大的特點就是溶質的分離是依靠于流體力學現象而非熱力學中的溶質在固定相和流動相之間的化學平衡[３５,3９]。在這種模式里，流動相相對較高的流速會在柱子內填料之間的空隙間形成流速梯度，大的DNA分子由于隨流動相移動得速度小，比小的更難通過填料顆粒，這樣小分子先于大分子被洗脫出來，其洗脫順序恰恰與排阻色譜模式相反[４６]，顯著影響溶質保留值的是各種流體力學因素有固定相顆粒的大小、流動相的流速和溫度，而化學因素有固定相顆粒的化學性質，孔徑和溶劑的疏水性并不是影響分離的關鍵因素[４７]。Hirabayashi等[４７]使用兩種CapcellPak反相填料和5種Hypersil3反相填料驗證了SC機理在使用反相色譜柱條件下的可行性，發現在流動相的鹽濃度增加時，DNA分子的保留值增大，其分離度也增大，他們認為這是一種SC和HIC同時存在的混合分離模式。然而Rittich等[４８]在使用HEMABIO1000填料研究流動相鹽濃度對分離的影響時，認為鹽濃度對分離幾乎沒有影響。SC*主要的優點在于快速和相對簡單的操作，如在使用凝膠色譜柱時，用SC能在2min內完成分子量分別為4、9和23kb的DNA碎片的分離[45]，增加流速可以進一步縮短分離時間。然而SC的分辨率卻低于SEC。為了提高其分辨率，Peyrin等[４4]提出了描述SC分離DNA分子的模型，得出流動相的粘度是影響DNA在SC分離中的重要因素。
　　
　　Hirabayashi等[４９]進一步系統地研究了SC中DNA分子的構型、溫度及溶劑的粘度對DNA分子保留的影響。結果表明，溶劑的粘度決定了DNA分子的保留程度，DNA分子構型影響其在SC中保留的是其分子長度，而非分子量，同時溶劑的粘度也和流速一樣是影響DNA分子保留的主要因素。
　　
　　4HDC與SC的異同點及聯系
　　
　　HDC主要利用在填料顆粒之間的空隙中產生的平流層來進行分離。無規則盤狀聚合物大分子的分離依賴于其有效半徑reff與填料空隙的有效管徑的比值。當流速增加時，溶質分子會拉伸并變形從而導致該比值的減小[2３]，而這種變形會隨著流動相流速、粘度和溶質分子體積增大而增加，當該比值大于一定程度時(＞0.35)，無法完成溶質的分離[１９]。而SC的分離強烈依賴于流動相產生的水動力效應，DNA分子在通過顆粒間的時候會發生形變和舒展，這樣在SC中，DNA分子的RRT才會與DNA分子的大小有一一對應的關系,且為顆粒直徑的函數[4４]，故HDC與SC可相互轉換[３２]，即當溶質分子為盤狀結構且流速較低時，此時溶質的盤狀形狀未發生變化，分離按照HDC進行；隨著流動相流速、溶質分子的體積增大到一定程度時，分離模式從HDC機理轉為SC機理，此結論在分離DNA片段[5０]和蛋白質[5１]中得到了證實。
　　
　　5展望
　　
　　HDC和SC借助于填料顆粒間的水動力效應對溶質進行分離。由于在分離過程中不需要滿足溶質與固定相之間的化學平衡，這樣消除掉了溶質與填料顆粒間的傳質過程。因此，提高了分離速度，使用流動相和SEC相同，對環境污染較小。由于分離只與動力學因素——流動相流速、粘度和填料粒徑有關，分離操作較為簡單。其“溶質保留值與流速之間有依賴關系”的結論為提高色譜分離度提供了一條新思路。從動力學上研究溶質的分離給現代分離科學開辟了更為廣闊的遐想空間。如：動力學因素改變時，溶質在各種分離模式中的分離情況、峰容量、分離度和洗脫順序會有何不同？溶質的分離度和流動相流速之間有何聯系？本實驗組研究了反相模式下動力學因素，即：流速對細胞色素C的肽譜的影響[５２]，發現在不同流速時，肽譜的分離情況、峰容量和分離度也各不相同，甚至部分溶質的洗脫順序也發生了變化，還發現了兩種變化規律，即溶質相對保留值(RRT)與流動相流速之間存在雙對數線性關系：log(RRT)=a blog(v)(4)以及所得該兩個線性參數，a與b之間的的線性關系：a=c db(5)該結果在液相色譜指紋圖譜研究和蛋白質組學中分離低豐度蛋白時有潛在的應用價值。目前由于HDC在操作過程中需要控制的流速較低，因此對儀器的要求較高，并且自SC提出以來，已發表的論文多集中在理論研究上，實際應用多限于分離一些DNA分子片段，因此二者的用途有待進一步發展和開拓。
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